Ambientato nell'Italia moderna, Gunslinger Girl segue un gruppo di ragazze ferite in modo traumatico prelevate dagli ospedali di tutto il paese, che vengono poi potenziate, indottrinate e addestrate ciberneticamente per essere assassine da un ramo segreto della Public Corporation for Social Welfare, Sezione 2 Ogni ragazza è assegnata a un conduttore maschio che sovrintende alla sua formazione, spiegazioni e condotta generale. Ogni conduttore è libero di "condizionare" il suo assassino cibernetico nella misura in cui ritiene opportuno, il che aumenta la letalità e la lealtà di una ragazza a scapito dell'individualità umana e della durata della vita.